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钙调神经磷酸酶是一种受Ca²⁺/钙调素调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，广泛存在于哺乳动物的组织细胞中，作为Ca²⁺信号下游的一种效应分子，参与多种细胞功能得到调节。在T细胞活化的信号传导中起到调节枢纽得到作用；在神经递质的释放、突触可塑性方面亦有重要的调节作用。新近的研究表明，CaN在心肌肥厚的发生发展中起到中心作用。

• 快速简便：全程60分钟。
  
• 取样量微：本法取样本量仅为25μL。
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。

• 试剂二应用液：
  取R2粉剂加入到R2稀释液中，溶解完全后待用，4℃保存3个月。
  
• 试剂三应用液：
  按试剂三贮备液∶试剂三稀释液=1∶10的比例配制，现用现配，用多少配多少，余下继续-20℃以下保存3天。
  
• 显色剂：
  用时取一瓶试剂五甲液加入一瓶已预温好的试剂五乙液中，充分混匀，需提前0.5小时配制，4℃保存至少可保存5天；如您的样本量很少，可按试剂五甲液∶试剂五乙液＝7∶6的比例进行配制，需多少配多少（按比例配制显色剂时要防止磷污染，最好用新的一次性吸嘴或是专用吸嘴）
  
• 0.1mmol/L标准磷应用液：
  用时将试剂七标准磷贮备液100倍稀释，即取0.1mL标准磷贮备液加双蒸水至10mL，现用现配。

• 具有微量、灵敏、快速的特点。
  
• 最好用一次性试验用塑料管或1.5mL EP管操作，避免磷污染是检测成败的关键。
  
• 所有配试剂的器皿均要专用防止磷污染。
  
• 操作过程中的提到的混匀，一定要用漩涡混匀器充分混匀；如果使用EP管操作，最好用圆底或平底的。如果用尖底的EP管，可以适当延长混匀时间，混匀更要充分。
  
• 测定本试剂盒的同时，要测定组织匀浆中的蛋白浓度，可以用我司的总蛋白试剂盒（考马斯亮蓝法，货号：SNM152）或总蛋白试剂盒（BCA法，货号：SNM078）。

• 酶促反应
  
  • 按下表加入各成分配制酶促反应体系
    

    成分	对照管	测定管
    试剂一：缓冲液	60μL	60μL
    试剂二应用液	25μL	25μL
    试剂三应用液	3μL	3μL
    待测样本		25μL
    混匀，37℃水浴20min。
    试剂四：终止剂	12μL	12μL
    样本	25μL

  • 混匀，离心3500转/分，离心10分钟，取上清50μL定磷。
• 定磷：
  
  • 按下表加入各成分配制定磷反应体系
    

    成分	空白管	标准管	测定管	对照管
    双蒸水	50μL
    0.1mmol/L标准磷应用液		50μL
    测定管上清			50μL
    对照管上清				50μL
    显色剂	500μL
    混匀，静置2分钟。
    试剂六：稳定剂	500μL

  • 混匀，室温静置5分钟，636nm处，0.5cm光径，双蒸水调零测各管吸光度OD值。
  • 标准管及标准空白管只需做1-2只。
    
  • 在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用双蒸水冲洗4～5次，以免磷污染。
    
  • 操作过程中的提到的混匀，一定要用漩涡混匀器充分混匀；如果使用EP管操作，最好用圆底或平底的。如果用尖底的EP管，可以适当延长混匀时间，混匀更要充分。

• 单位定义：
  规定每小时每毫克蛋白的钙调神经磷酸酶（CaN）分解底物PNPP产生1μmol无机磷的量为一个CaN的活力单位。
  
• 计算公式：
  

  CaN活力 (U/mgprot)	＝	OD测定－OD对照	×	标准品浓度 (0.1μmol/mL)	×	反应体系稀释 倍数(5倍)	×3÷	待测样本蛋白浓度 (mgprot/mL)
  		OD标准－OD空白

  
  注：
  
  • 样本在酶促反应体系中的稀释5倍，反应液总量为250μL，样本量为50μL；
    
  • 单位定义为每小时，操作过程中的反应时间为20分钟，所以乘以×3；
    
  • U/mgprot＝μmol Pi/mgprot/hour

• 小鼠5%脑匀浆，取25μL按操作表操作，0.5cm光径比色皿测定，测定管为0.878，对照管0.814，空白管0.029，标准管0.216，5%小鼠脑匀浆蛋白浓度2.6154mgprot/mL，组织中钙调神经磷酸酶(CaN)的计算：
  

  CaN活力 (U/mgprot)	＝	0.878－0.814	×0.1×5×3÷2.6154＝0.1963U/mgprot
  		0.216－0.029

  
  
• 小鼠2.5%肝匀浆，取25μL按操作表操作，0.5cm光径比色皿测定，测定管为0.817，对照管0.598，空白管0.029，标准管0.216，2.5%小鼠脑匀浆蛋白浓度2.9678mgprot/mL，组织中钙调神经磷酸酶(CaN)的计算：
  

  CaN活力 (U/mgprot)	＝	0.817－0.598	×0.1×5×3÷2.9678＝0.5919U/mgprot
  		0.216－0.029